脑声常谈丨啮齿动物甲状腺功能减退模型及方法评估
甲状腺功效减退（简称甲减）是一种甲状腺激素短缺的病理状况，除了会引起黏液性水肿、影象力减退和心动过缓等一系列甲状腺激素削减所带来的症状外，甲状腺激素的削减和匆匆甲状腺激素的增长也是全身多个体系疾病的自力危险因素。经由过程小鼠树立甲减模子的主流方式是药物造模，但药物造模无法避免药物对付甲状腺外组织发生的一系列作用从而影响试验成果。
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在动物模子中，诱导甲状腺功效减退的办法较多。经由过程敲除特异性甲状腺受体或去碘酶等基因，可造成稳固的甲状腺功效减退动物模子，然则基因敲除造模法式繁杂，必要消耗年夜量人力和光阴，通常获取一个基因剔除的纯合子小鼠必要年夜约1年光阴，且基因敲除纯合小鼠很难经由过程自身滋生得到纯合敲除的子女，以是，很难将基因敲除所造甲状腺功效减退模子小鼠进行年夜面积推广，但基因敲除造成甲状腺功效减退模子对付研讨中枢性甲状腺功效减退或去碘酶短缺等特殊类型的甲状腺功效减退具有弗成替代的上风。
抗甲状腺药物、放射性碘或低碘饮食均可造成试验动物甲状腺功效减退。抗甲状腺药物主要包含用丙硫氧嘧啶或甲巯咪唑豢养试验动物，造成动物血清T3、T4降落，TSH升高，该办法的长处是造模办法简单，胜利率高，但该办法造模所需光阴较长，且一旦结束喂药，甲状腺激素程度极为不稳固，甲状腺功效减退状况很快会消散，更为紧张的是，无法排除抗甲状腺药物对付动物机体其他器官及组织所发生的滋扰性影响。放射性碘注入试验动物体内后，被甲状腺所凝集，造成甲状腺细胞坏死，从而引起甲状腺功效的减退，但该办法对付造模装备要求较高，且存在放射性物资污染风险，在一样平常试验中利用较少。
低碘饮食造模，主要经由过程喂食试验动物低碘饮食实现，造模办法简单，但可控性较差，且用时较长，主要被用于研讨碘短缺相关疾病。
手术切除甲状腺可以快速造成试验动物甲状腺功效减退，且甲状腺功效减退状况较为稳固，该办法在很多试验中被利用，此中Wistar年夜鼠或SD年夜鼠被利用最多，甲状腺全切模子的树立不仅要求尽可能完备的将甲状腺切除，并且要求在手术同时，要尽可能的掩护甲状腺四周的紧张器官、组织，如气管、喉返神经、甲状旁腺及食管等，毁伤这些紧张器官或组织，将年夜年夜增长试验动物的致死率，甲状腺全切的小鼠模子报道较少也可能与其手术高殒命率有关。
动物模子的分组及树立
将C57BL/6和KM雄性小鼠各分为假手术组（5只）、术式I组（10只）和术式II组（10只），手术前所有小鼠均饮用纯清水和通俗年夜鼠维持饲料，术后假手术组继续术前饮食，术式I和术式II组年夜鼠以0.1%葡萄糖酸钙水和通俗小鼠维持饲料豢养。因为C57BL/6小鼠和KM小鼠体型及甲状腺剖解布局类似，故其手术办法同等。甲状腺的裸露：应用镇痛剂腹腔打针麻醉小鼠并固定，在小鼠对应颈后垫一块5cm×1cm×0.5cm纱布垫使术野更为裸露，自小鼠胸骨上窝的颈正中为出发点，向上切开皮肤约1cm，切开后可见左右两下颌腺由被膜相连，用眼科显微直剪钝性分别，分别后可见完备颈前肌，用眼科显微弯镊自瘦语视野正中轻轻提起颈前肌，眼科显微弯剪垂直于颈前肌正中刚好刺入肌组织，然后钝性分别约1cm。此时气管和甲状腺裸露于术野。将笼罩于甲状腺外侧的带状肌钝性分别，直至甲状腺与其完全分别，并用小拉钩将带状肌及其外侧组织拉开，充足裸露甲状腺。假手术组至此步调后缝合。
术式I：将甲状腺侧叶提起并轻轻翻转，裸露该侧甲状腺背侧于视野，从上级入针点结扎甲状腺上级动脉并沿线头近甲状腺侧将血管离断，注意应只管即便接近上极血管，并完全避免结扎到除血管、被膜之外的任何组织。用同样伎俩结扎另一侧甲状腺上动脉，紧贴结扎处，在线头靠甲状腺侧锐性离断上极血管，从一侧甲状腺上级开端沿被膜将甲状腺撕离气管，注意整个进程应保证甲状腺后被膜的完备性，并避免打仗喉返神经，直至剥离至离断另一侧上极血管。将摘除甲状腺放于4%多聚甲醛中固定。
术式II：起首提起一侧腺体，裸露上极血管，锐性离断上极血管，快速提起另一侧上极血管，并锐性离断血管，小棉签双侧轻轻按压止血30~120s，出血削减后，用与术式I同样伎俩剥离甲状腺组织。末了确认气管无甲状腺组织附着、无运动性出血后（若有出血可轻按压止血），轻取纱布垫，复位气管和带状肌，逐层缝合肌肉、下颌腺和皮肤，碘伏消毒皮肤，纱布笼罩。分离记载各组每只小鼠手术用时。
记载指标：
体重：于小鼠入组开端，逐日记载小鼠殒命环境；于术前第7天、术后第7、14、21、28天禀别记载各组小鼠体重环境。
血清甲状腺相关激素阐发：术前第7天和术后第28天，经由过程眼眶取血。1.5mLEP管网络血液，应用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中TT3、TT4及TSH含量。
行动学表示：
甲减小鼠呈现运动缓慢，倦怠嗜卧，体型瘦削，捕获时可以感觉到小鼠皮肉松弛，尾巴发凉，对抗力变小等表示。表示为少动嗜睡、脱毛等，可能是该阶段甲状腺激素浓度明显降落。
行动学测试办法
胆怯影象坚持测试（retention test）
单次电击训练24h后，将小鼠放回明箱，中央的拱门主动打开，记载小鼠进入暗箱的光阴埋伏期，整个试验进程均不给电击。经由过程计算小鼠在训练时初次受到电击的埋伏期、24小时后再次进入暗室的动物数、埋伏期等指标。联合化学遗传学办法、药理学手腕节制脑内胆碱能神经活性，评价胆碱能体系对甲减小鼠的认知功效影响。
新物体辨认实验
新物体辨认实验体系（Novel object recognition test）由测试笼（40×40×35cm）、高清摄像机、计算机及数据采集和阐发体系构成。该体系是依据小鼠的探讨行动，对新事物有显著的摸索倾向，从而树立起来测定小鼠进修影象才能的一种办法。该研讨办法是让动物在自由运动状况下测试其进修影象才能，外界滋扰因素小，得出的结论更有说服力。此外，本研讨手腕还可以测试动物的短期或历久影象形成机制等。新物体辨认实验进程主要分三步：顺应期、训练期和影象测试期。行动学试验开端前6天，天天对小鼠进行平和的触摸顺应（gentle handling），天天3次，每次2min，每次触摸之间的光阴距离应为15min以上。随后可进行新物体辨认实验，其详细步调为：
1.第一天，将小鼠依次放入试验记载笼中，顺应阶段该记载笼内无任何物体，使小鼠自由摸索5min对试验情况进行顺应，从而可削减试验时小鼠的应激性。每一批小鼠顺应停止后，以10%的乙醇干净记载笼，天然风干后，再开端下一批小鼠的顺应。2.第二天，在试验记载笼内底板的两侧对应的地位放置两个年夜小、外形、色彩完全雷同的物体（好比两个同样的乐高积木A1和A2），将小鼠轻轻放入试验记载笼的中心地位，让小鼠在试验记载笼内自由摸索10min后，掏出小鼠并放回原小鼠的饲养笼。每次试验停止，均以10%的乙醇干净记载笼，天然风干后开端下一批小鼠的训练。3.第三天，训练完成24h后，开端进行小鼠的影象才能测试。将试验记载笼的此中一个物体坚持不变（A1），另一个物体换为一个完全分歧年夜小、外形或色彩的新物体（A3）。A1为第二天训练时的认识物体，而A3想对付本来的物体（A2）则是一个别致物体。将小鼠从新放入试验记载笼的中心地位，让小鼠自由摸索5min，并记载小鼠摸索认识物体（A1）和别致物体（A3）的光阴。小鼠对别致物体的偏心可以用偏心系数进行量化，其计算办法为：N/（N+F）×100%，此中：N表现小鼠对别致物体（A3）的摸索光阴，F表现小鼠对认识物体（A1）的摸索光阴。以偏心系数评价小鼠的影象才能。
Morris水迷宫试验
海马是参和认知运动的紧张中枢部位。甲状腺激素对海马有直接或间接的心理作用，解释了甲减所致的神经行动学性能障碍。进行Morris水迷宫试验，装配：水迷宫反响桶，直径120cm，高度50cm，充自来水于25cm处，水温23~24oC，逃逸平台为直径6.5cm，高度15cm（最高平面在水下1cm），平台随机置于此中一个象限。4个几何图形作为线索，线索的外形分歧（三角形、菱形、正方形、圆形），色彩涂成玄色，宽15cm。且迷宫外线索固定。
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Morris水迷宫主要分为2个部门，定位航行试验、空间搜刮试验。定位航行试验：用于察看小鼠进修和影象的才能。操作：将小鼠头向上朝向池壁，拔取肇端象限，分离从4个象限各选一个入水滴。小鼠放入水中，试验开端。计算机定位小鼠，并进行跟踪、记载、计时，以入水至爬上平台所用时长记为逃避埋伏期。限定光阴为60秒。小鼠登上平台后使其停顿30秒再移开。若不克不及爬上平台，则由试验者领导待30秒后再移去。一次试验完成之后，下次试验开端前预留试验间歇。间歇期，所有小鼠用干毛巾擦拭，并置于暖风旁，注意保暖。天天接受4次训练，持续进行5天。空间搜刮试验：查验小鼠影象的读取及坚持才能。在训练后末了一天（第6天）将平台撤下，并由计算机圈定原平台地位，四个象限随机拔取一点将小鼠头向上面向池壁柔柔地置于水中，计算机记载其60秒内的游行路径，随后统计小鼠60秒内所穿越原平台地点地位的次数，共评估4次，取均值。
抗委顿作用试验
对甲减小鼠进行抗委顿作用试验。装配一：转棒式委顿仪。试验前24h做顺应性训练，设定为20min，记载小鼠跑步光阴，若20min仍未落棒记为20min。试验停止前一周截止，一周一次，持续测3周。用于F1和F2的抗委顿作用评估。装配二：YLS-10B转轮式委顿仪。通道设置为8，即8个通道同时运转。电击耐受光阴设定为2秒。活动难易水平设定为“中”。鉴定力竭为5分钟内3次。苏息光阴设定为30秒。转速设定为25r/min。刺激电流(限流)设定lmA。转轮转动，小鼠开端跑步。当小鼠电击也不在跑步时，电闸断电，末了一个小鼠结束时，电机结束。记下每只小鼠跑步的光阴。每周一次，持续测3周。用于F3的抗委顿作用评估。
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